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    百子蓮ApSBT剪切本在超低溫保存誘發PCD中的作用

    劉沛林  
    【摘要】:類枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin-like proteases,SBT)一類是與植物發育、防御反應相關的多功能的絲氨酸蛋白酶。本研究基于百子蓮(Agapanthus praecox ssp.orientalis`Big Blue`)超低溫保存中的轉錄組數據,篩選、克隆出全長的ApSBT基因,并發現了其剪切本ApSBT.2。ApSBT.1和ApSBT.2 mRNA序列長分別為2316 bp和2468 bp,其中ApSBT.1編碼771個氨基酸,預測蛋白大小為82.69 kDa。由于ApSBT.2發生了內含子保留型可變剪切,保留的內含子上含有一個終止密碼子,使得翻譯后蛋白序列僅含有115個氨基酸,預測蛋白大小為13.18 kDa。ApSBT.1屬于Peptidases S8家族的親水蛋白,具有典型的類枯草桿菌蛋白酶I9和S8結構域;而ApSBT.2僅包含一個類枯草桿菌蛋白酶的I9結構域。同源序列對比分析可知,百子蓮SBT蛋白與棕櫚科和禾本科等單子葉植物的SBT遺傳進化關系較近。亞細胞定位分析ApSBT.1主要位于細胞質,ApSBT.2主要位于細胞膜,但分子功能差異未知。研究發現,百子蓮EC(embryonic callus)超低溫保存中ApSBT.1和ApSBT.2基因的表達響應了超低溫復合逆境;模式植物輔助驗證,表明在轉基因擬南芥(Arabidopsis thaliana)超低溫保存后ApSBT.1降低了凍后成活率,而ApSBT.2則對凍后成活率略有提高。對轉基因擬南芥超低溫保存中DNA ladder、TUNEL、ROS水平、膜脂過氧化程度以及PCD(Programmed Cell Death)相關的類caspase酶活進行檢測,發現轉ApSBT.1和ApSBT.2基因擬南芥超低溫保存中OH~-為參與氧化應激的ROS主要組分,轉ApSBT.1基因擬南芥膜脂過氧化程度顯著高于野生型,而轉ApSBT.2基因擬南芥略低于野生型。另外,ApSBT.1提高了caspase-1、-3和-6蛋白水解酶的活性,而ApSBT.2減弱了caspase-6蛋白水解酶的活性。過表達ApSBT.1提前并加劇了百子蓮超低溫保存中PCD進程,而ApSBT.2則減弱了PCD進程,并表現出部分抑制ApSBT.1的功能,提高了植物體抵御超低溫保存復合逆境脅迫的能力。同時探究了ApSBT.1和ApSBT.2在超低溫保存單一非生物脅迫中的功能。在轉基因擬南芥單一脅迫成活率實驗中,ApSBT.1在氧化脅迫下成活率最低,僅為野生型的0.68倍,ApSBT.2在鹽脅迫下成活率最高,為WT的1.4倍。在單一脅迫下的表達量、成活率差異說明ApSBT.1和ApSBT.2應對非生物脅迫的響應模式不同,但相關機制有待進一步研究。綜上所述,本實驗初步揭示了類枯草桿菌蛋白酶在非生物脅迫誘導PCD中的作用,為后續進一步開發蛋白酶型冷凍保護劑提供了理論依據。


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